Distinct proteomes and allergen profiles appear across the life cycle stages of Alternaria alternata

― 31 Maggio 2024

Sintesi e commento in italiano a cura della Dott.ssa Anna Perino

Journal of Allergy and Clinical Immunology

Michael Brad Strader,  Aishwarya L. Saha, Chantal Fernandes, Kavita Sharma, Christian Hadiwinarta,  Daniela Calheiros, Gonçalo Condede- Oliveira,  Teresa Gonçalves, Jay E. Slater
Journal of Allergy and Clinical Immunology (in press)

Abstract

Premessa: L’Alternaria alternata è associata a malattie respiratorie allergiche, che possono essere gestite  con diagnostica e  con immunoterapia a base di estratti allergenici. Non è noto come spore e ife contribuiscano al contenuto di allergeni. Gli estratti commerciali di allergeni sono prodotti mediante estrazione delle proteine senza separare le diverse forme del fungo.

Obiettivo: Determinare le differenze tra i proteomi delle spore e delle ife e come gli allergeni siano distribuiti in A. alternata.

Metodi: Spettrometria di massa con acquisizione indipendente dei dati per confrontare quantitativamente i proteomi di spore asessuate (non germinanti e germinanti) con ife vegetative.

Risultati: Abbiamo identificato 4515 proteine in spore non germinanti, spore germinanti e ife; la maggior parte degli allergeni noti è più abbondante nelle spore non germinative. Confrontando i dati  di significative differenze di fold change (se un gene è upregolato o down regolato) delle proteine tra le spore non germinanti e le ife, 174 proteine sono risultate upregolate nelle spore non germinative e 80 proteine nelle ife. Tra le proteine delle spore vi sono  quelle coinvolte in modo funzionale nella sintesi della parete cellulare, nella risposta allo stress cellulare e nel mantenimento di equilibrio redox e omeostasi. Confrontando spore non germinative e germinative, 25 proteine sono state upregolate nelle spore non germinative e 54 in quelle germinative. Tra le proteine specifiche delle spore in germinazione vi  erano proteasi note come fattori di virulenza. Una delle proteine più abbondanti nel proteoma delle spore è la sialidasi, che non è stata identificata come  allergene ma può essere importante per la patogenicità di questo micete. Il principale allergene Alt a 1 è presente a bassi livelli nelle spore e nelle ife e sembra essere in gran parte secreta nei terreni di coltura.

Conclusioni: Le spore e le ife esprimono proteomi sovrapposti ma distinti. La maggior parte degli allergeni noti si trovano più abbondantemente nelle spore non germinative.

Capsule summary: l’allergia all’alternaria viene diagnosticata e trattata con estratti dell’allergene dell’alternaria, che sono prodotti da ife e spore di muffa non separate. L’analisi in spettrometria di massa di ife,  spore non germinative e spore germinative, accuratamente separate, hanno rivelato distinti proteomi per i 3 tipi di cellule. La maggior parte degli allergeni è più abbondante nelle  spore.

Riassunto

L’Alternaria alternata,  micete  presente sia in ambienti chiusi che all’aperto è un fitopatogeno ma  può suscitare malattie respiratorie IgE mediate  nei pazienti allergici ai suoi vari allergeni. L’allergia all’alternaria è stata  anche implicata in focolai di gravi attacchi d’asma  epidemica. La diagnosi di allergia IgE-mediata può essere effettuata mediante test cutanei  di origine estrattiva autorizzati secondo le leggi nazionali vigenti o misurando le IgE specifiche sieriche. Le opzioni di trattamento comprendono l’evitamento, la terapia farmacologica e l’immunoterapia con gli allergeni in parte ancora di origine estrattiva.

 L’Alt a 1, l’allergene  maggiore di A. meglio studiato, è un eterodimero di 31kD legato da ponti disolfuro con funzione biologica sconosciuta, associato alla parete cellulare delle spore  e secreto in coltura dopo un’incubazione relativamente prolungata e rilasciato in grandi quantità  a livello della mucosa delle vie aeree, probabilmente come risultato della germinazione delle spore.  L’immunoterapia con un di preparato Alt a 1 puro  al 95% è risultato efficace in un gruppo di soggetti sensibili all’Alternaria in uno studio controllato.

Sono stati identificati almeno altri 10 allergeni (allergen.org). Sebbene l’importanza relativa di molte di queste rimanga  incerta è dimostrato che alcune IgE reattive ad allergeni diversi dall’Alt a 1, come l’Alt a 6, l’Alt a 8 e l’Alt a 13, possono essere immunopatogeni in un gran numero di soggetti allergici.

Le spore fungine sono considerate la principale fonte di allergeni per l’esposizione umana agli allergeni, sebbene anche i miceli e i frammenti possano suscitare reazioni. Le spore di A. alternata sono di medie dimensioni, lunghe circa 20-63 μm e larghe 8-9 μm. Una volta depositate nell’ambiente umido della mucosa respiratoria, le spore germinano, il che porta al rilascio di allergeni che sembra essere direttamente collegato al tubo germinale e alla punta ifale in crescita. Estratti commerciali di A. alternata negli Stati Uniti e in Europa sono prodotti a partire da combinazioni variabili di ife, spore e frammenti da terreni di cultura. Gli estratti sono non standardizzati ed eterogenei con importante variabilità tra lotti. I  cicli vitali  delle muffe sono complessi e  quindi comprendere la comparsa di diverse proteine allergeniche in fasi di sviluppo specifiche potrebbe migliorare il controllo della produzione dell’allergene estrattivo.

Un recente tentativo di ottimizzare la crescita della muffa per l’espressione di Alt a 1 e Alt a 6 ha suggerito una squisita dipendenza dal tempo e dalla temperatura, ma non dalla fonte di carbonio.

Lo scopo generale  di questa ricerca è quello di migliorare i metodi per il controllo di qualità degli allergeni estratti per cui sono stati  sviluppati metodi per produrre profili riproducibili di estratti allergenici e per una misura accurata delle componenti allergeniche stesse.

Lo studio attuale è un’analisi proteomica comparativa delle spore di A. alternata, delle ife e dei prodotti commerciali  estrattivi autorizzati utilizzando la spettrometria di massa quantitativa che gli autori considerano l’analisi più completa ed esauriente dei proteomi di Alternaria a.

Sono ampiamente spiegati i materiali e i metodi utilizzati nello studio con relativi risultati dopo accurata analisi bioinformatica. Sono prese in esame le singole proteine allergeniche finora note con le loro funzioni.  Non si conosce la funzione di Alt A1 peraltro poco presente in cultura e poi abbondante nella mucosa respiratoria.

Di  particolare interesse è la sialidasi condivisa anche con altre specie fungine allergizzanti come Aspergillus e Candida.

Le proteine allergeniche dell’A.  conosciute  a livello internazionale  e studiate nel lavoro sono 13.

Messaggi chiave dell’articolo

  1. La diagnosi e il trattamento dell’allergia all‘Alternaria alternata con l’allergene dipendono dalla disponibilità di estratti che contengono allergeni rilevanti.
  2. Le spore non germinative, le spore germinative e le ife di A. alternata presentano overlapping ma proteomi distinti.
  3. La maggior parte, ma non tutti, gli allergeni noti dell’Alternaria sono più abbondanti nelle spore non germinative.

Commento

Per quanto questo lavoro sia  molto complesso e articolato  nella sua preparazione di tipo estremamente laboratoristico, ha un fine squisitamente clinico, cioè cercare di mettere a fuoco non solo la complessità biologica dell’Alternaria ma cercare di approfondirne il significato allergologico.

Per questo, oltre al raffinato studio dei proteomi  delle differenti parti  del micete, sono stati messi a confronto tre estratti diagnostici/terapeutici  studiandone anche il contenuto di allergeni  ritenuti finora più importanti.

Purtroppo i risultati non sono incoraggianti. I prodotti  in commercio sono di tipo estrattivo scarsamente caratterizzati, e con contenuto allergico molto diverso sia qualitativamente che qualitativamente che varia da lotto a lotto data la  notevole complessità della loro  preparazione come si evince dallo studio molto sofisticato condotto dagli autori.  Gli autori si augurano anche di poter contribuire con il loro lavoro ad una migliore caratterizzazione degli estratti utili alla diagnostica allergologica.

In realtà lo studio dell’allergia ai miceti  è sempre stato molto complesso sia per mancanza di conoscenza della loro biologia che della loro diffusione e presenza nei vari ambienti che  per possibilità diagnostico/terapeutiche.

L’ Alternaria è ben riconoscibile  con conteggi accurati mediante campionamenti  e studi di aerobiologia e possiamo conoscerne l’andamento  outdoor (fino a 7500 spore/m3 di aria) anche se molto variabile in base alle condizioni ambientali e  conosciamo anche quale sia la soglia che può determinare sintomi  (100 spore /m3) mentre è più difficile il campionamento indoor (circa 280 spore/m3 ). In generale in base alle nostre conoscenze tendiamo a considerare l’A. un allergene outdoor sulla base dei dati aerobiologici anche se in base a queste misurazioni anche la presenza indoor può essere scatenante.

Secondo WHO/IUIS gli allergeni fungini in generale rappresentano circa l’11% degli allergeni ambientali con un numero di  120 allergeni approvati   appartenenti a 31 specie di funghi.

La presenza  totale di spore  fungine  nell’atmosfera è valutata intorno a 50 mega tonnellate/anno, un numero che lascia abbastanza esterrefatti e fa notare come il mondo dei miceti sia ancora largamente sconosciuto per quanto vastissimo.  I funghi sono apparsi nel devoniano (circa 300 milioni di anni fa)  e sono attualmente considerati un regno a parte oltre a piante e animali. Le specie di funghi conosciute sono 120.000 ma molte sono ancora da scoprire e questo mondo così ricco di allergeni è soprattutto problematico per noi allergologi che dobbiamo valutarne le sensibilizzazioni e la patogenicità  (chi li considera solo a livello alimentare non ha questi problemi). Eppure  anche i funghi alimentari sono un insieme di ife (sì anche i tartufi!) che hanno bisogno di disperdere le loro spore nell’aria per riprodursi.

Ad oggi, l’allergia alla A. sta diventando un problema di salute globale considerando che la sua prevalenza ha raggiunto il 12,9% negli Stati Uniti, dove è considerato come l’ “acaro americano”, e 8,9% in Europa. Le stime della prevalenza contemporanea non sono disponibili per l’Italia e i valori storici probabilmente sottovalutano la prevalenza dato l’aumento globale nella prevalenza di allergia di A. In pratica, la nostra diagnostica offre poche possibilità con estratti  scarsamente caratterizzati (come sottolineato sotto)  che comprendono solo una parte degli allergeni. La diagnostica molecolare  ci  aiuta e ci permette di rilevare Alt a1, e Alt a6. Di conseguenza la nostra diagnostica è limitata anche sul micete che conosciamo meglio  e più diffuso e forse l’allergia all’A. è sottostimata nella nostra attività quotidiana. Dal punto  di vista anamnestico è importante  sottolineare  la situazione geografica del paziente:  l’Alternaria è un fitopatogeno  e quindi particolarmente presente in vicinanza di ampie coltivazioni.

Nello studio in esame, sono stati considerati tre prodotti  estrattivi commercializzati in USA  (nell’articolo ci sono i nomi commerciali) rilevando la presenza degli allergeni contenuti con differenze molto significative:

  • nel prodotto 1: Alt a1 , Alt a3 ( con presenza elevata di Alt a1)
  • nel prodotto 2: Alt a1, Alt a3, Alt a6 , Alt a8, Alt a10, Alt a14 (con bassa presenza di Alt a1 e molto elevata  di 3, 6, 8 e 14)
  • nel prodotto 3: Alt a1, Alt a3, Alt a6 (con presenza sovrapponibile)

Nell’articolo si fa un breve accenno anche  alle possibilità terapeutiche  citando l’evitamento (non così semplice date le caratteristiche del micete), la terapia sintomatica e l’immunoterapia antiallergica. Purtroppo su quest’ultimo punto  per noi si  concentrano tutte  le limitazione viste finora.

 La scarsa conoscenza generale  dell’Alternaria, della sua allergenicità,  le limitazioni diagnostiche (e anche quelle regolatorie)  e i pochi studi controllati in realtà non ci permettono di usare appieno un trattamento fondamentale nella nostra pratica  e che potrebbe essere di grande aiuto soprattutto in vista dell’importante aumento di sensibilizzazioni a livello globale e della capacità dell’alternaria di essere il trigger di ulteriori sensibilizzazioni.

 La prescrizione di immunoterapia all’A. in Italia rappresenta circa il 2% delle prescrizioni totali soprattutto in campo pediatrico, indice dell’attenzione che allergologici e pediatri pongono anche su questo particolare sensibilizzante nonostante tutte le difficoltà  indicate.

Speriamo che nuovi studi e nuove conoscenze e anche nuovi prodotti ci diano maggiori chances di immunoterapia antiallergica  verso questo micete così particolare!

Articolo originale

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